免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)服务
IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的Fc片段的现象开发出来的方法。目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心,可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。
实验仪器:
名称 |
规格型号 |
品牌 |
超高速离心机 |
OptimaL- 100XP |
Beckman |
超低温医用冰箱 |
﹣80℃冰箱 |
Haier |
小型垂直蛋白电泳仪 |
垂直式 |
BioRad |
半干转移槽 |
半干转移 |
BioRad |
水平脱色摇床 |
TS-1 |
QILINBEIER |
微量离心机 |
Pico17 |
赛默飞世尔 |
微量离心机 |
Fresco17 |
赛默飞世尔 |
实验基本流程
1. 收获细胞,加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上或者4℃裂解30min, 12,000g离心30 min后取上清;
2. 取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;
3. 免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去,protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液,沸水煮10分钟;
SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
免疫共沉淀(CO-IP)服务
基本步骤
准备IP buffer,IP buffer(含PMSF)
4. 转染或处理后36h,冷PBS洗细胞,收集细胞。吸干水后,可冻存在-80℃。
5. 冰上裂解20分钟,间断颠倒混匀。
6. 加入IP buffer(含PMSF),冰上超声裂解。
7. 离心收集上清,取50ul作为 input。
8. 1ml冷IP buffer洗flag M2 珠子。
9. 10ul 珠子/六孔板的一孔。洗珠子后用等体积IP buffer重悬。
10. 加珠子,4℃,翻转过夜。
11. 5000rpm 1分钟,弃上清。
12. 洗珠子,弃上清,加入2X SDS 上样缓冲液。100℃ 5分钟,4℃ 5分钟裂解。
13. 取出液体,WB。
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