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【实验动态】免疫沉淀原理及基本步骤

来源:作者:热度:Loading...日期:2015-03-20, 08:42 AM

免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理

  IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FCFc片段的现象开发出来的方法目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心,可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。

免疫共沉淀原理

免疫沉淀实验从:蛋白样品处理;抗体-agarose beads孵育;抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量,才能最终达到的实验目的。

实验准备:             

 

1) 收集的细胞、flag肽段溶液、mouseIgGbeads、Flag-M2beads

2) 设备:超低温冰箱、离心机、制冰机、超声波仪、振荡器、微型移液器

3) 试剂:PBS、IP buffer PMSF 丙酮

 

实验基本操作步骤:

 

1.        收集细胞,收集至离心管,3000rpm离心5min倒掉上清。PBS清洗一遍,吸干液体再次离心,吸干液体。

2.        加入适量细胞IPbuffer(含PMSF),冰上或者4℃裂解20min,每5min上下颠倒混匀。 (为防止蛋白酶的作用,细胞裂解液应当预冷。所有接下来的操作都在低温条件下进行,并且蛋白酶抑制剂预先添加到细胞裂解液中

3.        冰上超声裂解细胞。 超声时,声音刺耳为正常现象。声音较小效果不好。可见液体变澄清。溶液不澄清时可再超声3-6min,至液体澄清即可。

4.        4000rpm离心收集上清液。

5.        直接加入50ul mouse IgG beads(先摇匀,mouse IgG beads较细小,容易被戳破,在吸取前应把枪头尖端剪掉,避免破坏珠子),4℃旋转,至少2小时。

6.        离心4000rpm,转移上清至新的15ml 离心管。

7.        直接加入50ulmouse IgG beads(先摇匀),4℃旋转,至少2小时。

8.        离心,转移上清至新的15ml 离心管。各取50ul 做input,留做样品。

9.        flag-M2 beads 取100ul用1ml Ip buffer洗一次,离心,弃上清。15ml离心管中加入50ul flag M2 beads,4℃旋转过夜。(flag-M2 beads用甘油保存,使用前要混匀并用IPbuffer清洗干净

10.    离心,吸出上清50ul,留做样品。剩余1ml转入1.5ml离心管。

11.    高速离心,弃上清,加1ml IP buffer,重复清洗,弃上清。(小心并尽量完全地移除上清液后用IP buffer清洗,为减少非特异背景影响,每次洗涤都要尽量小心并完全地移除上清液。

12.    加入 flag肽段溶液(用IP buffer按说明书溶解),涡旋仪上剧烈震荡后离心 ,转移上清至新管。

13.    beads中再次加入flag肽段溶液,涡旋仪上剧烈震荡,离心,合并上清。剩余的beads彻底吸干,加入1ml IP buffer洗一次,离心,彻底吸干液体,留做样品。

14.    裂解液离心,彻底去除beads污染,收取上清。

15.    按14比例在200ul样品中加入800ul-20℃预冷的丙酮,放入-20℃, 4h。取出300ul,留作样品。

16.   17000g离心20分钟,弃上清,剩余大约100ul,加入800ul预冷的丙酮,振荡。

留取的样品暂时不用,保存于-80℃保存。

鉴定:可SDS-PAGE Western blotting进行分析。

缓冲液的制备参考

NP-40 Cell Lysis Buffer:

50mMTris-Hcl pH8.0,150mMNacl, 1% NP-40

Protease inhibitor Cocktail:

PMSF, 5mg (50ug/ml)

Aprotinin, 100ug (1ug/ml)

Leupeptin, 100ug (1ug/ml)

Pepstatin, 100ug (1ug/ml)

100% Ethanol bring up to 1ml,aliquot

上样buffer的配方(用前现配):

2ul        1.25M Tris-HCL , pH 6.8

35ul       distilled water

2.5ul       2-mercaptoethanol

12.5ul      10%SDS

10ul       80% glycerol

2ul        bromphenol blue

TNE buffer:

10mM Tris-HCl pH 8.0

10mM NaCl

0.5mM EDTA

 


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