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免疫印迹(Western Blotting)

免疫印迹(Western Blotting)的基本原理:

免疫印迹是一个用于蛋白质分析的常规技术,在电场的作用下将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持物,然后利用抗原-抗体的特异性反应,从蛋白混合物中检测出目标蛋白,从而定量或定性的确定正常或实验条件下细胞或组织中目标蛋白的表达情况。

实验基本操作流程

1 细胞裂解物的准备;细菌诱导表达后,可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞,真核细胞加匀浆缓冲液,机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃,13,000g离心15min。取上清液作为样品。

2 细胞裂解物的蛋白定量;BCA检测波长为562nm为避免假阳性结果,先把lysis buffer加入BCA工作液混合看是否产生颜色。测完蛋白含量后,计算含50~100ug蛋白的溶液体积即为上样量。上样前样品在金属浴95℃、冰浴5min充分裂解。之后样品可以在4℃冰箱短时间保存,也可在-80°冰箱保存数月。

3 细胞裂解物的SDS-PAGE;制备电泳凝胶,进行SDS-PAGE。

4 蛋白质的转移;(半干式转移)

① 电泳结束后将胶条割至合适大小,用转膜缓冲液平衡,5min×3次。

② 膜处理:预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜,浸入转膜缓冲液中10min。

③ 转膜:转膜装置从下至上依次按极碳板、海绵、2层滤纸、凝胶、NC膜、2层滤纸、极碳板的顺序放好,滤纸、凝胶、NC膜精确对齐,每一步去除气泡,上压500g重物,将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒压100V,转移1~1.5hr(根据蛋白分子量 大小适当增加或者减少转模时间)。转移结束后,断开电源将膜取出,用丽春红染色液染色5min,用PBS涮洗2遍拍照留做对比。

免疫反应:

1)1x PBS洗膜,5min ×2次。

2)加入包被液,平稳摇动,室温1hr。

3)弃包被液,加入一抗(按合适稀释比例用5%脱脂牛奶(脱脂牛奶用PBS溶解),液体必须覆盖膜的全部),4℃ 放置12hr以上。弃一抗PBST(0.067M PBS+0.1%tuwen)洗膜,5min×4次。

4)加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.067M PBS稀释),平稳摇动,室温2hr。

5)弃二抗,用PBST洗膜,5min×4次。

6)加入显色液,避光显色至胶片透明为止;用自来水洗去残留的定影液后,室温下晾干


凝胶图象分析:

胶片进行扫描或拍照,用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值

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实验周期:

大约一周,根据样品量多少不同实验周期有所不同。

 

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