Science：上海药物所揭示HIV感染人体细胞机制

新闻发布会现场

文章第一作者谭秋香介绍CCR5研究过程

文章唯一通讯作者吴蓓丽研究员介绍CCR5的三维结构及其对于艾滋病毒感染机制研究的意义

9月12日，美国《科学》杂志-美国科学促进会（Science-AAAS）在中国科学院上海药物研究所召开新闻发布会，介绍中科院上海药物研究所吴蓓丽研究员研究组在趋化因子受体CCR5结构生物学领域取得重大突破性进展。相关研究成果发表在Science上，吴蓓丽研究员为唯一通讯作者，上海药物研究所为第一单位。这也是《科学》杂志-美国科学促进会第一次在上海召开的新闻发布会，之前仅在北京做过一次新闻发布。

CCR5是一种位于细胞表面的受体蛋白质，作为艾滋病毒共受体之一，在大多数种类艾滋病毒感染人体免疫细胞时发挥重要作用。然而，其三维结构的解析极具挑战性，长久以来一直困扰着国内外科学家。日前，由中国科学院上海药物研究所和美国Scripps研究所的科学家组成的研究团队终于在该项研究中取得了突破性研究成果，成功解析了CCR5蛋白质分子的高分辨率三维结构，并据此揭示了抗艾滋病毒感染的药物马拉维若是如何作用于该受体分子进而阻断病毒入侵的分子机制。

发表在《科学》杂志的最新研究结果揭示了人体细胞表面受体CCR5的三维结构，大多数种类的艾滋病毒利用CCR5进入人体免疫细胞。图片显示抗艾滋病毒药物马拉维若通过与CCR5结合将其锁定在非活性状态，从而抵制艾滋病毒侵染人体细胞。（图片由吴蓓丽研究组提供） 

“这些结构信息将帮助我们更加准确地理解艾滋病毒感染细胞的机制，并有助于研发出更为有效的抗艾滋病毒感染的新型药物，”中国科学院上海药物研究所的吴蓓丽研究员说。吴蓓丽研究员是该项研究的负责人，相关研究成果于2013年9月12日发表在国际权威杂志《科学》（Science）上。

这项针对艾滋病毒共受体CCR5的研究获得了来自中美两国的科研经费支持，“解决重大科学难题需要更多类似的国际合作，”该研究的主要合作者之一——美国加州Scripps研究所的Raymond C.Stevens教授说，“目前我们已经解析了两种艾滋病毒共受体CXCR4和CCR5的三维结构，抗艾滋病毒感染新方法的研究也将有望取得突破。”

重要靶点

CCR5受体是新型抗艾滋病毒药物研发中最受关注的靶点之一。最初，人们认为艾滋病毒仅通过受体CD4的作用即可感染人体细胞，直到1996年，科学家才发现艾滋病毒感染还需要共受体（通常是CCR5）的共同作用。研究人员发现某些特定的CCR5突变体能够显著地提高或降低人体被艾滋病毒感染的几率以及被感染后病情发展的速度，例如，研究发现约百分之十的欧洲人体内具有一种截短的CCR5突变体，该突变体无法在细胞表面表达，而携带这种突变体的人群对于艾滋病毒的感染几乎是完全免疫的。至此，CCR5在艾滋病毒感染中的重要作用才引起人们的重视。

科学家们希望可以据此研发出抗艾滋病毒感染的药物，通过与CCR5的竞争性结合或使CCR5受体分子处于非活性状态而阻断艾滋病毒的入侵，目前已有少量此类抑制剂被研制成功，然而在此之前它们的作用机制仍无法被明确阐明。“我们缺少的就是可用于精确药物设计的CCR5受体分子的高分辨率结构，”吴蓓丽研究员说。

艰苦探索

2007年，吴蓓丽博士加入Scripps研究所Stevens教授的研究组开展博士后研究工作，致力于艾滋病毒的两种共受体CCR5和CXCR4的结构生物学研究。CXCR4是除CCR5外的另一种艾滋病毒共受体，少数种类的艾滋病毒以CXCR4为共受体，与CD4共同作用完成病毒入侵过程。

Stevens教授说：“从一开始她的目标就是解析这两种艾滋病毒共受体的结构并据此阐释其功能，这一明确目标一直激励着她的研究工作。”在博士后工作期间，吴蓓丽博士的研究主要集中在CXCR4受体上，她取得的重大研究成果——CXCR4的晶体结构于2010年发表在《科学》杂志上，这些工作为CCR5的结构测定奠定了基础。2011年，吴蓓丽博士加入中国科学院上海药物研究所组建自己的研究团队，在药物研究所的支持下，她继续深入该项研究，进一步探索CCR5的三维结构。

CCR5和CXCR4均属于人体内最大的受体蛋白家族——G蛋白偶联受体（GPCR）。由于GPCR蛋白表达难度大，获得足够量的用于结构研究的蛋白质样品非常困难；并且，由于GPCR蛋白构象不稳定，获得可用于X射线衍射的蛋白质晶体也极具挑战。与CXCR4相比，CCR5的结构解析需要克服更多的困难，但是，凭借解析CXCR4结构的成功经验，吴蓓丽研究员领导她的年轻团队进行了大量的筛选和优化工作，利用一种新的融合蛋白稳定了CCR5蛋白的构象；同时，与上海药物所的蒋华良、柳红和谢欣等三位研究员的研究组在计算机模拟、化合物合成和药理功能筛选等方面进行合作；最终获得了高质量的蛋白质晶体，成功解析了CCR5的三维结构。

与其他GPCR受体结构解析类似，吴蓓丽研究员的团队还利用一种可与CCR5特异性结合的化合物稳定其构象，这种化合物就是辉瑞公司研制的药物马拉维若（在美国以外地区销售的商标为Selzentry®和Celsentri®），马拉维若于2007年获批上市用于抵抗艾滋病毒感染，这种药物可抑制以CCR5为共受体的艾滋病毒侵染人体细胞。“我们认为马拉维若能够将CCR5的构象锁定在一种非活性状态，希望能够在高分辨率分子水平‘看’到这种构象，”吴蓓丽研究员说。

CCR5的三维结构信息揭示了其抵抗艾滋病毒结合的精细构象，以及马拉维若在受体分子中的精确结合位点。虽然该结合位点与公认的艾滋病毒结合位点不同，且与CCR5天然配体的作用区域也不相同，但药物分子仍可有效地抑制受体的功能，因此，马拉维若可能是通过间接机制抑制CCR5与艾滋病毒的结合，即不直接与病毒竞争结合CCR5，但通过其与CCR5的结合改变CCR5的分子构象，使其处于艾滋病毒非敏感状态，从而实现阻断CCR5与病毒结合的功效。

中国科技部等部门与美国国立卫生研究院（NIH）共同资助了该项研究。NIH综合医学研究所的Peter Preusch博士这样评论该项研究：“蛋白质三维结构信息可揭示蛋白质与药物分子的相互作用机制，并且有助于新型治疗药物的研发。这一研究成果揭示了马拉维若与抗艾滋病毒药物靶点CCR5的相互作用模式，可以帮助人们在分子水平理解该类药物的作用机理，有助于在生物学角度进一步研究艾滋病毒，并促进此类作用模式的靶向药物研究。”

重要发现

大多数种类的艾滋病毒在侵染人体细胞初期以CCR5为共受体，但是经过一段时间后，病毒共受体转化为CXCR4，使得人体中更多类型的细胞被感染，加剧了病毒在人体内的进一步扩散、加速了疾病的发展，最终导致艾滋病的发生和患者死亡。因此，利用此项研究成果比较CCR5结构与之前解析的CXCR4结构异同，可以为艾滋病毒感染机制研究提供重要线索。

比较结果表明，艾滋病毒对于共受体的选择性可能是由CCR5和CXCR4这两种共受体的结构在形状及电荷分布等方面的细微差异造成的，这些特点对于抗艾滋病毒的药物研发具有重要意义。正如吴蓓丽研究员所说：“了解CXCR4和CCR5的结构信息将加速抗不同种类艾滋病毒的药物研发。”目前，她的研究团队正进一步深入，希望通过解析CCR5和CXCR4与艾滋病毒表面蛋白gp120以及CD4的复合物结构，为研究病毒感染机制提供更多信息。此外，CCR5结构解析之后，上海药物所已组织团队联合攻关，开展基于结构的药物设计，目前已获得抗病毒活性更好的化合物，进一步说明了CCR5结构对于研发抗艾滋病毒药物的重要作用。

除了吴蓓丽研究员和Raymone C. Stevens教授以外，该项研究（Structure of the CCR5 Chemokine Receptor –HIV Entry Inhibitor Maraviroc Complex）的参与者还包括中国科学院上海药物所的谭秋香、朱亚和来自吴蓓丽、赵强、柳红、蒋华良、谢欣等研究组的多名研究人员，以及美国Scripps研究所的Gye Won Han、Gustavo Fenanlti、VadimCherezov和加州大学圣地亚哥分校的Irina Kufareva。

该项研究获得了包括科技部“973计划”（2012CB518000、2012CB910400）、美国国立卫生研究院（R01 AI100604、U54 GM094618及其中美生物医药合作研究补充项目）、国家自然科学基金委（31270766、81161120425、81025017）和上海市科委（11JC1414800、12PJ1410500）的资助。

原文检索：

Qiuxiang Tan, Ya Zhu, Jian Li, Zhuxi Chen, Gye Won Han, Irina Kufareva, Tingting Li, Limin Ma, Gustavo Fenalti, Jing Li, Wenru Zhang, Xin Xie, Huaiyu Yang, Hualiang Jiang, Vadim Cherezov, Hong Liu, Raymond C. Stevens, Qiang Zhao, Beili Wu.Structure of the CCR5 Chemokine Receptor–HIV Entry Inhibitor Maraviroc Complex. Science, September 12 2013; DOI:10.1126/science.1241475

附：新闻发布会现场发言稿

CCR5的三维结构及其对于艾滋病毒感染机制研究的意义

吴蓓丽博士

中国科学院上海药物研究所、中国科学院受体结构与功能重点实验室研究员

人免疫缺陷病毒（艾滋病毒，HIV）的危害众所周知，人体感染该病毒可能导致艾滋病的发生。自1981年美国发现首例艾滋病患者以来，艾滋病迅速发展成全球规模的流行病，已导致全球约三千万人死亡。艾滋病毒感染人体细胞的第一步是病毒与细胞的膜融合，这一过程由病毒表面糖蛋白gp120与细胞表面的受体CD4以及共受体CCR5或CXCR4共同作用完成。为了阐明艾滋病毒侵入细胞的分子机制，科学家们进行了大量的研究。经过努力，研究人员在结构生物学领域取得了多项突破，其中包括gp120与CD4复合物的结构解析，但是由于共受体CCR5和CXCR4属于G蛋白偶联受体（GPCR）膜蛋白家族，其结构解析极具挑战性，因此这两种共受体的结构与功能关系一直未能被明确阐明。

我们希望通过解析这两种共受体的三维结构，从而深入理解艾滋病毒感染人体细胞的分子机制。六年前，当我在美国Scripps研究所Stevens教授的研究组从事博士后研究时就开展了相关工作。在Stevens教授的支持下，我于2010年成功解析了人源CXCR4受体蛋白与两种配体的复合物晶体结构，相关研究成果发表在《科学》杂志上。2011年，我加入中国科学院上海药物研究所组建研究团队，在药物所的支持下继续深入该项研究，进一步探索CCR5的三维结构。由于仅有少量CCR5抑制剂被成功研制，因此与其它结构已知的G蛋白偶联受体相比，CCR5的结构解析更具挑战性，但是，CXCR4结构测定的成功经验帮助我们更好地解决了在CCR5研究过程中出现的各种难题。在Stevens教授和赵强研究员的帮助和支持下，我的研究团队在CCR5蛋白的表达、纯化和结晶方面进行了大量的工作，同时与蒋华良、柳红和谢欣三位研究员的研究组在计算机模拟、化合物合成和药理功能筛选等方面开展合作，最终成功解析了CCR5与一种抗艾滋病毒药物——马拉维若复合物的蛋白质结构。

根据上述研究，我们获取了两个重要的发现：首先，解析CCR5和CXCR4这两种共受体的结构有助于我们深入理解艾滋病毒感染人体细胞的分子机制，以及决定病毒蛋白gp120结合的各种因素。人体内蛋白质的神奇之处在于，即使是极少数氨基酸的不同，也可能显著影响蛋白质结合区域的形状和分子识别能力。比较CCR5和CXCR4的结构，我们发现这两种受体分子的配体结合口袋在电荷分布和空间位阻等性质上的差异，可能是艾滋病毒对共受体具有选择性的主要原因。此外，CCR5的结构揭示了药物马拉维若在受体分子中的精确结合位点，该结合位点与公认的gp120结合位点不同，因此，马拉维若可能是通过间接机制抑制CCR5与艾滋病毒的结合，即不直接与病毒竞争结合CCR5，但通过其与CCR5的结合改变CCR5的分子构象，使其处于艾滋病毒非敏感状态，从而实现阻断CCR5与病毒结合的功效。CCR5与配体的相互作用模式，及CXCR4晶体结构信息，为研发抵抗不同类型艾滋病毒感染的新型药物打下了坚实的基础。

CCR5的研究获得了来自科技部“973计划”、美国国立卫生研究院、国家自然科学基金委和上海市科委的经费支持。同时，我衷心感谢上海药物研究所和美国Scripps研究所的所有同事给予我们的巨大支持，没有他们的帮助，我们无法在如此短的时间内取得这一重要成果。

上海药物所GPCR研究的又一黄金时期到来

蒋华良博士

中国科学院上海药物研究所副所长

中国科学院上海药物研究所药物发现与设计中心研究员

中国科学院上海药物研究所自建所以来，一直致力于基于中国特有的中草药及天然产物的新药研发工作，药物所的创始人兼首任所长赵承嘏院士即为该领域的先驱者。上世纪20年代，赵先生针对具有镇痛活性的传统中草药延胡索开展研究，希望可以确认其镇痛活性成分。经过八年（1928-1936)的艰苦研究，赵先生得到了13种延胡索成分生物碱样品晶体。然而，受制于当时的科技水平，缺乏合适的药理筛选模型，仍无法确认其具体活性成分。直到约25年后，药物所的金国章院士等科学家又经过八年（1956-1964）的潜心钻研方才确认了延胡索中镇痛活性成分为左旋四氢巴马丁（罗通定，L-THP ）。金先生还发现，L-THP可拮抗单胺受体活性，因此除镇痛作用外还具有安定作用。1964年，L-THP作为镇痛药物经药监局批准上市。基于对L-THP构效关系及其分子药理学的研究，金先生又发现了包括四氢小檗碱、左旋千金藤啶碱等在内的一系列小檗碱类天然产物的作用机制。特别是上世纪八十年代发现的可用于治疗精神分裂症的小檗碱类化合物，通过分子药理学研究，发现其可以调节包括多巴胺受体和5-羟色胺受体在内的多个G蛋白偶联受体（GPCR）活性，这些研究成果为抗精神分裂症和抑郁症的药物研发奠定了坚实的基础。

上世纪八十年代，池志强院士领导的科研小组在上海药物所开展以阿片受体为靶点的镇痛药物研究工作，他们发现了一种极其强效的镇痛药羟甲芬太尼（β-羟基- 3 - 甲基），该配体分子可与阿片受体选择性特异结合。因此，药物所具有丰富的GPCR研究历史，包括其天然产物配体的发现及新药研发。

上世纪八九十年代，随着分子生物学的发展，GPCR受体分子的研究迎来了革命性的突破。然而，由于文革的动荡和老一代科学家的退休，药物所的GPCR研究及相关药物研发工作错过了此黄金时期。2007年以来，上海药物所陆续有多个研究组重新开始了GPCR药理学研究并建立了一系列的筛选模型。在此期间，我们目睹了GPCR结构生物学的飞速发展，药物所的领导班子意识到，我们亟需引进GPCR结构生物学人才。幸运的是，2010年，徐华强博士受聘于药物所筹建GPCR结构生物学平台；2011年，两位年轻的GPCR结构生物学家吴蓓丽博士和赵强博士加盟药物所；同时，他们的导师——国际GPCR结构生物学领军人物——Raymond C. Stevens教授也以客座教授身份加盟药物所。药物所GPCR结构生物学研究在Stevens教授和徐华强研究员的指导下，通过与药物所药物化学家、药理学家和计算生物学家的密切合作，取得了飞速发展，仅用了两年时间就取得重大科研成果，其中Stevens教授和徐华强教授合作解析了两个5-羟色胺受体结构，相关成果发表于今年三月份的《科学》杂志；Stevens教授和王明伟教授合作解析的胰高血糖素受体结构，相关科研成果发表于《自然》杂志。

今天，我们正在见证GPCR研究的又一重要事件——吴蓓丽研究员及其研究团队即将在《科学》杂志发表趋化因子受体CCR5与艾滋病毒抑制剂马拉维若复合物的X射线晶体结构。对于这一里程碑式的成果，我深感欣慰。首先，我为青年人才吴蓓丽研究员在药物所获得的成功感到高兴，药物所一直努力为青年科技人才提供良好的学术环境；同时，我也为我和我的团队可以有幸利用我们的计算模型直接参与此项研究工作而感到高兴。本项研究成果将加速抗艾滋病毒药物的研发。在药物所，我们多方紧密协作，在CCR5结构解析过程中，柳红研究员的科研团队和谢欣研究员的科研团队合成并筛选了多种配体分子以稳定CCR5蛋白分子结构；吴蓓丽研究员的科研团队获得CCR5的结构数据后，我们又立刻开始了基于CCR5结构的药物设计、合成及新化合物的筛选。由于这种紧密高效的合作，目前我们已经获得了数种抗艾滋病毒感染的先导化合物，且其抗病毒功效优于目前临床使用的药物马拉维若。

现在，我很高兴地宣布，药物所GPCR研究的辉煌再次重现！我们将不负老一辈科学家的期望，努力工作，传承药物所GPCR研究的光辉成就并将其发扬光大。今天，我希望大家可以在这里共同见证上海药物所GPCR研究和药物研发的另一个黄金时代的开始，未来药物所的GPCR研究将更加激动人心！

GPCR结构、功能研究、药物研发及国际合作

Raymond Stevens 博士

美国Scripps研究所分子生物学系与化学系教授

上海科技大学iHuman研究所首任所长

经过20年的艰苦研究，Stevens教授的研究组于2007年成功解析了人β2 -肾上腺素受体高分辨率晶体结构，该项研究成果发表于《科学》杂志。随后，Stevens教授和他的研究团队陆续在多个人源GPCR蛋白的结构生物学、结构-功能关系研究及药物研发方面取得到了突飞猛进的进展，包括腺苷受体A2A、多巴胺受体D3、趋化因子受体CXCR4、5-羟色胺受体5HT1B和5HT2B、组胺受体H1、磷酸鞘氨醇受体S1P1、胰高血糖素受体、SMO受体、δ--阿片受体、κ-阿片受体及痛敏肽受体。迄今为止，已发表的21个GPCR蛋白晶体结构中有14个是由Stevens教授及其研究团队完成的。其中最重要的成果包括与Receptos公司合作解析的磷酸鞘氨醇受体S1P1结构，Receptos公司是由美国Scripps研究所基于GPCR结构的小分子药物研发平台发展而来，Receptos公司仅用了四年时间，就研发出一种可用于治疗多发性硬化症和肠炎的S1P1受体激动剂，并通过了临床二期和三期实验，该公司于2013年5月在纳斯达克上市。GPCR受体的晶体结构信息为包括受体动力学模拟、配体对接和虚拟配体筛选在内的药物研发提供了坚实的三维结构框架。在目前的新药研发中，基于结构的虚拟配体筛选和优化越来越显示出巨大优势，在针对腺苷受体A2A、趋化因子受体CXCR4、多巴胺受体D3、组胺受体H1等GPCR蛋白的先导化合物筛选优化工作中，小分子配体筛选的准确率高达20%-70%。同时，通过对相近GPCR蛋白进行结构-功能关系研究，如5-羟色胺受体和阿片受体，可以更清晰地了解其信号传导的分子机制，尤其是利用了何种生物学通路。此外，超高分辨率GPCR晶体结构研究对某些重要的生物学功能进行了新的探索，例如胆固醇和钠离子等对GPCR的变构调节机制。同时，利用核磁共振技术(NMR)，揭示了GPCR在跨膜信号传导中对信号通路的选择偏好性。最近，第二家基于GPCR结构生物学的药物研发公司——锐医在上海成立，公司主要致力于利用新技术开展以GPCR为靶点的新药研发工作，以期解决目前难以用小分子药物解决的医学难题。

GPCR相关研究虽然已经得到了飞速发展，然而，GPCR家族非常庞大，包括826个成员，其中与人类疾病相关的重要药物靶点至少有300余种，目前超过40%的上市药物以GPCR为靶点。以目前的科研水平，如果要全面地了解这个人体内最大蛋白质家族，至少需要几十年。并且，开展GPCR结构生物学研究及基于此的药物研发工作耗资巨大，仅靠一个国家的科研机构和科研经费支持无法完成，因此大力开展国际合作对未来该领域的发展至关重要。美国国立卫生研究院和中国国家自然科学基金委共同资助的一项中美生物医学合作研究项目，为GPCR蛋白的研究提供了科技人才和经费支持，此项目的启动加强了美国Scripps研究所GPCR网络中心与中国科学院上海药物研究所间的国际合作。此项工作是由上海药物研究所的两位年轻研究员吴蓓丽和赵强，以及Scripps研究所的Stevens教授领衔完成的，吴蓓丽研究员和赵强研究员曾在Stevens教授研究组接受过系统的GPCR结构生物学理论知识和实验技能训练。在美国国立卫生研究院、中国国家自然科学基金委、以及上海药物研究所的丁健所长和蒋华良副所长等的大力支持下，上海药物研究所已成功建立了GPCR结构生物学研究平台。利用该平台，吴蓓丽研究员领导其研究团队成功解析了艾滋病毒共受体CCR5的高分辨率晶体结构，这一成功与她长久以来的科研热情和孜孜不倦的钻研、奉献精神密不可分。目前，GPCR结构生物学研究领域保持着良好、紧密的国际协作关系，可以在全球范围内进行协调，避免重复浪费的科研力量投入。

利用先进的技术平台以及良好的合作基础，我们将侧重于研究CCR5和CXCR4这两种相近受体之间的细微异同之处，配体结合位点上的微小差异对于相近受体蛋白识别病毒等分子的机制研究至关重要。CXCR4和CCR5结构的成功解析是GPCR结构生物学研究的重要突破，也是长期不懈努力的结果。同样重要的是，CXCR4和CCR5的高纯度蛋白样品的获得为运用其它生物物理手段进一步研究艾滋病毒感染机制铺平了道路。两种艾滋病毒共受体的三维结构的解析，为相关药物研发奠定了基础，新一代抗艾滋病毒药物的研究将很有可能取得突破性进展。